無菌車間又叫無菌室，它的要求更高，除了按潔凈室要求處理空氣中微粒外，還需要對室內空氣進行處理，即同時要去除生物污染源，對室檢查還需要對室內空氣采樣培養，以杜絕感染源。醫院手術室、血液透析室、藥品及三類一次性醫療用品生產都要求使用無菌室；但是檢測時需要檢測浮游菌、沉降菌等菌落數。

無菌定義是要求沒有活體微生物的存在，為了達到無菌車間內沒有活體微生物，無菌車間在產品制造過程中需要采取各種方法來去除制品中原有的微生物和防止制品受到微生物的污染。那么，在無菌車間中，使空間內達到無菌要求，就是室內環境控制的重點?？刂莆⑸锏纳L、殺滅或去除微生物的方法通常有兩種，一種為化學類，另一種為物理類。其中，化學方法有化學劑、氣化雙氧水、臭氧和環氧乙烷等；物理方法有濕熱或干熱、輻射和過濾等。

無菌容器和密封件以及灌裝封口作業的局部暴露區域內空氣的潔凈度應達到100級要求，該潔凈度下每立方米空氣中含有≥0.5靘的粒子數應不得過3500個，空氣浮游菌的含量應不得超過5CFU/m3。

無菌操作區域內的100級潔凈區內的空氣在其使用點處應經過濾器過濾后呈單向流態（層流）輸送，流速應滿足空氣以活塞的方式吹除灌封區內的懸浮粒子的需要。

在獲得了無菌環境和無菌材料后，還要保持無菌狀態，才能對某種特定的已知微生物進行研究或利用它們的功能，否則外界的各種微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的現象，在微生物學中叫做污染雜菌。防止污染是微生物學工作中十分關鍵的技術。